Book/Report

FZJ-2019-00748

http://join2-wiki.gsi.de/foswiki/pub/Main/Artwork/join2_logo100x88.png Untersuchungen zur Aktivität der 2 -xoglutarat-Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum und Charakterisierung des Gens für die Dihydroliponamid-Dehydrogenase-Untereinheit

Schwinde, J. (Corresponding author)FZJ*

1995
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag Jülich

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/21381

Report No.: Juel-3115

Abstract: Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die 2-OxoglutaratDehydrogenase in dem Glutamatproduzierenden $\textit{Corynebacterium glutamicum}$ nachzuweisen, die Regulation zu untersuchen sowie das Gen für die Dihydroliponamid-Dehydrogenase, einer Untereinheit dieses Enzyms, zu isolieren und zu charakterisieren.1. Die 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase konnte im Rohextrakt von $\textit{C. glutamicum}$ mit einer spezifischen Aktivität von 0.15 U/mg Protein nach Wachstum auf Komplexmedium und einer spezifischen Aktivität von 0.05 U/mg Protein nach Wachstum auf Minimalmedium nachgewiesen werden. Die unterschiedlichen Enzymaktivitäten nach Wachstum auf den verschiedenen Medien weisen auf eine Regulation der Genexpression hin. Auf enzymatischer Ebene wurde die 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase durch Succinyl-CoA, NADH, DL-Jsocitrat und Glyoxylat gehemmt. 2. Das Gen für die Dihydroliponamid-Dehydrogenase aus $\textit{C. glutamicum}$ wurde mittels markierter Oligonukleotid-Sonden auf einem 5.4kb-$\textit{Bam}$HI-Fragment identifiziert und isoliert. Die DNA-Sequenzanalyse ergab, daß das Gen eine Größe von 1407bp hat und für ein Polypeptid mit 469 Aminosäuren kodiert. Das Polypeptid besitzt im Vergleich zu Dihydrohponamid-Dehydrogenasen aus anderen Organismen bis zu 42% identische Aminosäuren. 3. Untersuchungen auf Transkriptionsebene ergaben, daß das Gen für die Dihydroliponamid-Dehydrogenase aus $\textit{C. glutamicum}$ monocistronisch ist, die Länge des Transkriptes ungefähr 1.5kb beträgt, und der Transkriptionsstart mit dem Translationsstartpunkt identisch ist. Die Dihydroliponamid-Dehydrogenase wurde durch Ultrazentrifugation und FPLC bis zur Homogenität gereinigt und der Amino-Terminus ansequenziert. Der experimentell bestimmte Translationsstart stimmt mit dem aus der DNA-Sequenz abgeleiteten Start der Translation überein. 4. Der Stamm $\textit{C. glutamicum}$ (pEKO lpd5.4), der das Gen für die Dihydroliponamid-Dehydrogenase plasmidgebunden enthält, zeigte eine 12fach höhere Dihydroliponamid-Dehydrogenase-Aktivität (1.90 U/mg Protein) als der Wildtyp (0.16 U/mg Protein). In den überexprimierendenStämmen lagen die Gesamtaktivitäten der 2-OxoglutaratDehydrogenase und der Pyruvat-Dehydrogenase um 50-70% niedriger als in den Ausgangsstämmen. 5. Durch "Gen-gerichtete" Mutagenese wurde eine definierte im Gen für die Dihydroliponamid-Dehydrogenase defekte Mutante, $\textit{C. glutamicum}$ JS1, konstruiert. Der Phänotyp wies auf fehlende Aktivitäten der 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase und der Pyruvat-Dehydrogenase hin. Allerdings erwies sich der Stamm als instabil, was darauf deutet, daß das Dihydroliponamid-Dehydrogenase-Gen für $\textit{C. glutamicum}$ essentiell ist.

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Contributing Institute(s):

1. Publikationen vor 2000 (PRE-2000)

Research Program(s):

1. 899 - ohne Topic (POF3-899) (POF3-899)

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Database coverage:

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